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    饲料中霉菌毒素与脱毒剂的研究进展
    发布时间:2013-6-7 16:06:54   阅读数:2503   

    饲料中霉菌毒素与脱毒剂的研究进展


    摘要
    本文论述了霉菌毒素对饲料工业的影响,它的产生条件,饲料中常见的霉菌毒素种类及霉菌毒素的检测方法,对饲料中霉菌毒素的控制方法进行了讨论。介绍了霉菌毒素脱毒剂的种类和作用机理,特别是对各种霉菌毒素物理脱毒剂即霉菌毒素吸附剂的脱毒效果与脱毒机理、改良方法进行了讨论,针对国内外在此领域的最新研究进展,探讨了各种脱毒剂在实际应用中的优势与不足以及今后的研究方向。
    关键词:霉菌,霉菌毒素,霉菌毒素脱毒剂,饲料
    一、
    霉菌与霉菌毒素对饲料的污染
    霉菌对饲料的污染是十分常见的,可以说所有饲料都可以作为霉菌生存的环境。而由饲料传播的霉菌毒素就有可能在这些饲料中存在。饲料被霉菌污染后,主要引起两个方面的危害:一是由霉菌引起的饲料的变质,一是因霉菌产生的毒素而引起的动物中毒。饲料中的霉菌毒素还可能通过食物链而对人体产生危害。霉菌污染饲料后可使之饲用价值降低,甚至完全失去商品价值,从而巨大的经济损失。霉菌毒素的危害具有明显的地方性和季节性,动物在进食过程中可能一次吞食多种霉菌毒素而引起中毒。
    霉菌毒素对人及动物的危害性已经被人们所公认(Hussein and Brasel, 2001)。衡量一个国家或地区霉菌毒素对饲料污染严重程度有两个标准,一是饲料中霉菌毒素的含量,一是动物的霉菌毒素中毒频率。霉菌毒素的污染也并不只局限于发展中国家,一些发达国家也同样存在着霉菌毒素的污染问题。一般而言,年均气温较高的国家和地区这一问题较为严重,特别是处于热带和亚热带的发展中国家,因为这些国家往往缺少足够的干燥、贮藏饲料及饲料原料的设施和设备,加上热带和亚热带高温高湿的气候条件又有利于霉菌的生长和毒素的产生。
    二、
    霉菌毒素产生的条件
    能产生毒素的霉菌可以被称为产毒霉菌,并不是所有霉菌都产生毒素(但即使是不产毒素的真菌在饲料中生长也会造成饲料营养价值的降低),且产毒素霉菌菌种中也只是一部分菌株产生毒素。同一菌株的产毒能力可以表现出可变性与差异性,这与该菌株的生长环境有关,如饲料的营养成份、饲料贮藏的环境等。同一菌种或菌株又往往可以同时产生几种毒素,且同一毒素也可以由几种不同的霉菌产生。 
        2.1 温度
    大多数对饲料有害的产毒霉菌都属于中温型微生物,生长温度4-60℃。产毒霉菌并非在所有适于生长的温度条件下都能产生毒素,如黄曲霉毒素的产生温度为11-37℃,当温度为37℃时只产生黄曲霉毒素B1。 
        2.2 湿度
    相对于细菌而言,霉菌对湿度的要求较低,它们可以在最低的湿度环境中生长。一般而言,饲料中常见的产毒霉菌在越低的湿度中生长越慢,产生毒素也需要有一定的湿度环境。如黄曲霉毒素生成的最低相对湿度为83%,而黄曲霉生长的最低相对湿度为80%(30℃时)。当温度、pH、营养因子等条件较差时,毒素产生的相对湿度则要求更高一些。 
        2.3 pH 
        霉菌可以在比较广泛的pH值范围生长,但毒素产生所需的pH值范围则相对较窄,多数霉菌毒素在酸性pH值范围产生,而这正是饲料pH值的一般范围。与湿度一样,产生毒素所需的pH值范围也受到了营养因子等环境因素的影响。 
        2.4 营养因子
    霉菌生长基质中的各种营养因子可以对霉菌的生长和毒素的产生有影响。如含糖量高或蛋白质含量较高的基质较适于黄曲霉毒素的产生,1%-3%的食盐对黄曲霉毒素的产生有促进作用。饲料中的各种微量元素也对毒素的生成有一定的影响。
    三、
    饲料中常见的霉菌毒素
    在饲料中常见的产毒素霉菌主要有:曲霉属(Aspergillus)中的黄曲霉(A. flavus)、赭曲霉(A. ochraceus)、杂色曲霉(A. versicolor)、构巣曲霉(A. nidulans)、寄生曲霉(A. parasiticus)和烟曲霉(A. fumigatus)等。青霉属(Penicillium)中的岛青霉(P. isandicum)、桔青霉(P. citrinum)、黄绿青霉(P. citreo-vinide)、红色青霉(P. rubrum)、扩展青霉(P. expansum)、圆弧青霉(P. cyclopium)、纯绿青霉(P. viridicatum)和斜卧青霉(P. decumbens)等。镰孢菌属(Fusarium)中的禾谷镰孢菌(F. graminearum)、三隔镰孢菌(F. tritinctum)、玉米赤霉菌(Gibberella zeae)、梨孢镰孢菌(F. poae)、尖孢镰孢菌(F. oxysporum)、雪腐镰孢菌(F. nivale)、串珠镰孢菌(F. maniliborme)、拟枝孢镰孢菌(F. sporotrium)、木賊镰孢菌(F. equisti)、茄病镰孢菌(F. solani)、粉红镰孢菌(F. roseum)等。
    另外,麦角菌属(Claviceps)、鹅膏菌属(Amanita)、马鞍菌属(Helvella)和链格孢菌属(Alternaria)等也是较为常见的产毒霉菌。
    各种霉菌可以产生多达数百种霉菌毒素(William, 1989; Moss, 1996; Rotter et al., 1996; Sweeney and Dobson, 1998),但目前研究还主要集中在十几种对人类危害特别大且污染频率高的霉菌毒素,如黄曲霉毒素(Aflatoxins),赭曲霉毒素A(Ochratoxin A),杂色曲霉毒素(Sterigmatocystin),烟曲霉毒素(Fumonisins),展青霉毒素(Patulin),玉米赤霉烯酮(Zearalenone),串珠镰刀菌素(Moniliformin),三硝基丙酸及单端孢霉烯族毒素(包括T-2毒素,脱氧雪腐镰刀菌烯醇等)。随着对霉菌毒素的研究的不断深入,已经有越来越多的霉菌毒素被人类所发现和认识。
    黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉所产生的一种对人类危害特别大的强烈致癌物质,也是最常见的霉菌毒素。黄曲霉毒素在1961年首次从霉变花生粉中提取出来后,进一步的研究发现了许多黄曲霉毒素的衍生物和相似物,所以它是指一类结构类似的化合物而非一种化合物。
    四、
    霉菌毒素的检测
    饲料中霉菌毒素的检测方法大致可以分为几类:第一类是理化检测方法,如薄层层析色谱法(Lin et al, 1998)、气相色谱法、液相色谱法(Papp et al, 2002)、毛细管电泳法(Pena et al, 2002;曾红燕等,2003)、液质联用(Rosenberg et al, 1998; Rundberget and Wilkins, 2002)、气质联用(Tanaka et al, 2000)等;第二类是生物活性检测法,如皮肤毒性试验、种子发芽试验、体外细胞毒性多通道评估法(MEIC,Ekwall et al, 1998)、生物传感器法(van der Gaag et al, 2003)等;第三类是代谢物检测法,如测定动物尿液中的二氢鞘氨醇法(Solfrizzo et al, 1997);第四类是免疫化学检测方法,如ELISA方法等。另外还有研究者采用的是以上方法的联合。
    目前我国对霉菌毒素的检测和监督对象主要集中在食品和进口商品当中,对饲料中霉菌毒素的检测和控制较为忽视,而国外发达国家对饲料中的霉菌毒素含量以及肉类中霉菌毒素的残留量却十分重视,也有较为严格的检测标准(Berg, 2003)。这类标准很可能正在或将被某些发达国家用来设置对中国商品的贸易壁垒。有些发展中国家,如巴西,虽然政府主管部门对饲料用玉米的霉菌毒素残留量要求不高,但私人公司却十分重视这一问题(Salay and Mercadante, 2002)。随着我国加入WTO后市场的开放,我国对饲料及肉类中霉菌毒素的检测和控制必将越来越严格,并最终会和国际接轨。
    五、
    饲料中霉菌毒素的控制及霉菌毒素吸附剂的使用
    饲料中霉菌毒素的控制可以从多种途径进行,如控制好饲料的原料质量,防止饲料原料如玉米在生产前就霉变;控制好饲料的加工过程,特别是控制好饲料的水分及高温制粒后的降温过程;控制好饲料的贮藏和运输,防止饲料因潮湿、高温、包装损坏、昼夜温差太大、雨淋等因素而霉变;在饲料中加入足量的防霉剂;在饲料中加入霉菌毒素解毒/吸附剂预防或清除毒素。
    中国农业部允许使用的饲料防霉剂品种有甲酸、甲酸钙、甲酸铵、乙酸、双乙酸钠、丙酸、丙酸钙、丙酸钠、丙酸铵、丁酸、乳酸、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钠、山梨酸钾、富马酸。丙酸及丙酸盐是目前国内及国际最常用的饲料防霉剂,属酸性防霉/防腐剂,对人体无毒性,对各类霉菌、芽胞杆菌及革兰氏阴性杆菌有较强的抑制作用,对酵母的生长基本无影响。在较高的pH的介质中仍具有较强的抑菌作用。丙酸及其盐类在饲料中使用丙酸/丙酸盐的防霉效果已经在长期实践中得到了证实。它们还可以与双乙酸钠配合使用达到很好的效果。
    有多种物理、化学和生物学的方法可用来降解或吸附饲料中的霉菌毒素,从而防止毒素对饲养动物的伤害,但大多数方法无法在饲料中大量、有效并低成本地实现(Doyle et al, 1982; Samarajeewa et al, 1990)。下列方法来减轻或防止霉菌毒素的毒害作用:
    混合稀释法:将霉变饲料与未霉变饲料进行简单地混合,以降低饲料中霉菌毒素浓度。该方法虽然操作简单,成本低,但该方法未从根本上解决问题,由于饲料中的毒素依然存在,且仍可被动物吸收,所以可能导致毒素在动物体内的积累进而危害人类健康。
    化学降解法:采用氢氧化钠、氨、次氯酸钠、氯气等化学物质对霉变饲料进行处理,使毒素分解,以降低毒性。该方法缺点是成本较高,操作困难,特别是在处理时营养物质会被破坏而使饲料的营养价值和适口性降低,因此无法在饲料的生产中采用。
    微生物降解法:有一些特定的微生物可以降解霉变饲料中的霉菌毒素(Bata and Lasztity, 1999)。但该方法在现有的研究水平上操作困难,成本较高,尚无法达到工业化阶段。
    体内降解法:通过在饲料中添加某种物质,动物在吸收该物质后可以促进霉菌毒素在动物体内的降解或排泄。这类方法正在研究当中。
    物理降解法:采用物理的方法,如采用γ放射线的方法来降解霉菌毒素和杀死霉菌(Aziz and Moussa, 2002)。这类方法正处于研究阶段,并且使用时需要采用特殊的设备和防护方法。
    物理吸附法:即在饲料中添加可以吸附霉菌毒的物质,使毒素在经过动物肠道时不被动物所吸收,直接排出动物体外。这是目前饲料市场上较为成熟较可行的一种毒素解毒方法。
    有多种物质可以用于霉菌毒素的吸附,许多研究者对它们的吸附能力、吸附特异性和吸附机理进行了研究。这些通过物理吸附作用来脱毒的物质是通过释放自由能(ΔG)来提供吸附所需能量的。最重要的吸附特征是这些吸附剂的物理结构,这包括它的总电荷量、电荷的分布、孔隙的大小及可用的表面积(比表面积)。同样的,要被吸附的毒素分子的极性、可溶性、分子大小、分子形状、电荷分布等特征在吸附过程中也是至关重要的。相对于体外吸附试验而言,体内试验(喂养试验)中吸附剂对霉菌毒素的吸附量难以测定和计算。这样,各吸附剂的吸附效能只能通过动物的表现来反应,如体重的增加、料肉比、死亡率,血液、组织或器官中毒素的浓度等指标。体外试验往往不能反映出这些吸附剂的吸附选择性,一旦它们加入谷物或饲料中,某些营养成份也可被它们吸附,而这些营养成份在基质中的浓度远高于其中的毒素浓度,结果吸附剂被营养成份饱和而不能吸附毒素。因此,体外试验与体内试验结果有可能会出现相反的结果(Garcia et al, 2003)。
    目前用于物理吸附的物质主要是铝硅酸盐类的毒素吸附剂(Huwig et al, 2001),活性碳也可用于棒曲霉毒素(Mutlu and Gokmen, 1998)和赭曲霉毒素A(Galvano, 1998)的吸附,有不少研究者也利用酵母细胞壁成份来吸附霉菌毒素(Yiannikouris et al, 2003)。
    活性炭是一种具有高比表面积的多孔不溶性粉末状物质,它的比表面积可以达到500-3500 m2/g。在体外试验中,活性炭对霉菌毒素可以表现出较好的吸附脱毒作用(Galvano, 1997; Galvano, 1998; Bauer, 1994);但在体内试验(喂养)中,不同的研究结果给出了不同的结论(Hatch et al, 1982; Edrington et al, 1996; Bauer, 1994),这可能是由于活性炭的选择吸附能力较差,被饲料中的某些营养成份所饱和而失出了对毒素的吸附力。活性炭对土霉素具有很强的吸附能力(Alegakis et al, 2000),这也表明它的选择吸附能力较差。
    天然铝硅酸盐如沸石、蒙脱石、硅藻土、高岭土等,因为具有较大的比表面积和离子吸附能力,对霉菌毒素有一定的选择吸附能力而引起研究者的兴趣。将铝硅酸盐矿物用于霉菌毒素吸附的研究最早始于20世纪70年代(Mumpton and Fishman, 1977),不过,天然铝硅酸盐矿物吸附力小,效率低,占饲料容量大,对营养物质有一定吸附,因而直接用于饲料效果不好。对天然的铝硅酸盐进行改性后可以性善它对霉菌毒素的选择性吸附能力。如提取自沸石的水合铝硅酸钠钙对黄曲霉毒素B1有较好的选择性吸附能力(Ramos and Hernández, 1997;Philips, 1998;王彦波等,2002;齐德生等,2002)。在黄曲霉毒素B1的吸附试验中,未处理的斑脱土、水合钙斑脱土、水合钠斑脱土、水合钠钙斑脱土的吸附能力分别是67.39%,55.51%,80.83%和68.55%(Chaturvedi et al, 2002)。
    大量研究表明,水合铝硅酸钠钙对其它几种主要的霉菌毒素吸附能力不是太好,如对玉米赤霉烯酮(Bursian et al, 1992)、赭曲霉毒素A(Huff et al, 1992; Bursian et al, 1992; Bauer, 1994;)、T-2毒素(Kubena et al, 1990)及双乙酸基草镰刀菌醇(diacetoxyscirpenol)(Kubena et al, 1993a)的吸附效果不佳。这是因为霉菌毒素是一大类具有不同的功能基团的复杂的有机化合物,不同的霉菌毒素具有完全不同的理化性质。例如,黄曲霉毒素的基本结构单位是一个双氢呋喃环和一个氧杂萘邻酮;玉米赤霉烯酮是一种二酚化合物;赭曲霉毒素A是具有羧基和酚基基团的化合物;T-2毒素和脱氧雪腐镰孢菌烯醇是倍半萜烯化合物。基于粘土类矿物(蒙脱石或沸石)的吸附剂具有亲水性的负电荷表面,适于吸附带有极性基团的霉菌霉素,如黄曲霉毒素;而那些极性不强的霉菌毒素(如玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素)则不易被这些矿物所吸附(Santin et al, 2002)。对硅藻土的吸附性能研究表明,它对各种毒素的吸附力排序是:黄曲霉毒素B1>柄曲霉毒素>黄曲霉毒素M1>T-2毒素>玉米赤霉烯酮及赭曲霉毒素(Natour and Yousef, 1998)。
    对铝硅酸盐类表面基团或电荷分布进行适当改性之后,可以使新形成的物质获得新的理化特征,从而改善其对其它霉菌毒素的吸附能力。如蒙脱石经过十六烷基吡啶或十六烷基三甲铵处理后,蒙脱石矿物表面对水的亲和力下降,疏水性能提高,所以对疏水性的玉米赤霉烯酮有更高的亲和力,对玉米赤霉烯酮的吸附能力大大提高(Lemke et al, 1998; 2001)。
    沸石矿物表面带负电荷,用高分子量的四级胺(如八癸基二甲基苄胺)来置换矿物表面的部分天然正离子(Na+,K+,Ca2+,Mg2+等)可以改善沸石表面的疏水性能(Dakovi? et al, 2003; Toma?evic-?anovi? et al, 2003)。这些胺离子只能置换沸石外表面的正离子,而对于饲料霉菌毒素吸附剂来说正需要这种只是部分置换的矿物吸附剂,因为保留大部分天然正离子有助于它们对极性霉菌毒素(如黄曲霉毒素)的吸附。这些经过改性的有机化沸石保留了对黄曲霉毒素麦角碱的高吸附力,同时对玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、呕吐毒素(Vomitoxin)的吸附能力大大改善。
    总而言之,铝硅酸盐类吸附剂对黄曲霉毒素有良好的吸附能力,并且有不少体内(喂养)试验结果证实了这类吸附剂的实际效果(Rizzi et al, 2003),但它们存在对玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、单端孢菌素等毒素吸附能力不足的问题。不过通过适当的改性有可能使它具有更广泛的吸附能力。这类吸附剂的另一个缺点是,它们表现出了对维生素及矿物盐的非选择性吸附能力。
    除铝硅酸盐类以外,研究者和生产者也在不断地探索新的霉菌毒素吸附剂,并且取得了一定的进展。消胆胺(Cholestyramine)是一种阴离子交换树脂,一般用于肠道中吸附胆汁酸及降低低密度脂蛋白和胆固醇浓度。在体外试验中表现,这种树脂可以吸附赭曲霉毒素A(Bauer, 1994)和玉米赤霉烯酮(Ramos et al, 1996b),吸附量分别是9.6 mg/g和0.3mg/g。在体内试验中,消胆胺仅能略微降低受试动物血液、胆汁和组织中的赭曲霉毒素浓度(Ramos et al, 1996b)。Avantaggiato等(2003)采用动态体外胃肠模型进行的试验结果则表明,消胆胺可以使小肠对玉米赤霉烯酮的吸附率从32%下降到16%。
    酵母或酵母的细胞壁成份也作为霉菌毒素吸附剂使用(Bauer, 1994)。酵母细胞壁对毒素的吸附能力要明显强于酵母的全成份,这说明酵母细胞壁的特殊结构对霉菌毒素产生吸附力。细胞壁上有多糖、蛋白质和脂类,这些物质对毒素的吸附是通过氢键、离子键和疏水作用力等实现的。试验结果表明,酵母细胞壁可以吸附2.7mg/g玉米赤霉烯酮,并且这种吸附平衡可以在10分钟内达到,在这一点它比铝硅酸盐类吸附剂有优势(V?lkl and Karlovsky, 1998,1999)。
    葡甘露聚糖对霉菌毒素也有一定的吸附能力,Swamy等(2002)进行的猪体内试验结果表明,葡甘露聚糖对镰刀菌产生的毒素有一定的脱毒作用。葡甘露聚糖的作用方式应和酵母细胞壁的作用方式相似。
    从现有的研究来看,任何一种单一的吸附剂都不能将所有霉菌毒素都吸附(因为不同霉菌毒素分子有不同的理化性质),但是,通过将不同类型的吸附剂进行适当配比或对吸附剂进行改性将是一个很好的研究方向。
    上海三维饲料添加剂有限公司通过采用一种新型的非铝硅酸盐的高分子物质SAK,生产出一种新型的霉菌毒素吸附剂。这种高分子物质SAK具有特异性的吸附力,能够选择性地吸附饲料中的霉菌毒素,且对饲料中营养物质没有影响。SAK不被动物吸收,可随粪便排出体外。SAK也是一种有很高比表面积的化合物,具有独特的多孔结构,其分子孔内表面积远大于分子外表面积,这就为SAK捕捉霉菌毒素提供了结构位点。随着对霉菌毒素吸附剂研究的深入,将会有更多的新产品被开发出来。
    霉菌毒素吸附剂与防霉剂是否可以互相代替呢?答案是否定的。防霉剂的作用是防止霉菌在饲料中的生长,进而防止饲料营养成份的损失和霉菌毒素的产生;而霉菌毒素吸附剂的作用是将已经产生毒素吸附掉,从而防止动物吸收这些毒素,或者加入吸附剂以吸附饲料在贮藏期内可能产生的少量毒素。未霉变饲料中如果不加入防霉剂,霉菌就有可能在贮藏期内生长并产生大量毒素,在吸附剂达到饱和之后,吸附剂就不能再起作用了。而在已经产生一定霉变的饲料中(特别是饲料的原料就已经有一定霉变时),只加入防霉剂虽然可以抑制霉菌的进一步生长,但已经产生的霉菌毒素仍然会对畜禽产生毒害,这时只能通过加入毒素吸附剂来减轻或消除这种毒害了。因此,两者的配合使用,可以达到最理想的效果

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